NGS primer for illumina Miseq (시퀀싱 프라이머, microbiome)

Index sequencing primer in NGS

 

Rob Knight, et al. (2010)

 

연구실에서 흔하게 수행하는 PCR에서는 paired-end로 수행하는 경우 forward, reverse 등 두 개의 프라이머를 사용하지만 DNA pooling을 통해 많은 수의 샘플을 한 번에 시퀀싱 하는 NGS의 경우에는 추가로 'index sequencing primer'가 필요하다.

위의 사진에서 등장하는 Read 1, Read 2는 흔히 사용하는 forward, reverse 프라이머로 양방향에서 target sequence를 증폭시킨다. 

 

Index sequencing primer 는 barcode sequence 가 붙어있는 방향이 forward 라면, forward primer + pad + linker에 상보적인 뉴클레오타이드 시퀀스로 해당 위치에 부착하여 barcode + adapter 를 증폭시키는 데 사용된다. 

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barcode : 96개 또는 384개의 샘플을 pooling 하여 한번에 시퀀싱 하는 NGS에서는 barcdoe sequence 가 필수적인데, 이는 forward와 reverse primer 중 한 개의 앞에 붙어있는 고유한 12 개의 뉴클레오타이드로 이루어져 있다.

 

adapter : adapter라는 이름은 NGS에서 많은 의미로 사용되는데 여기서 말하는 adapter는 flow cell에 특이적으로 결합할 수 있는 서열을 의미한다.

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그렇다면 pad, linker 는 무엇일까? 이후 내용은 microbiota에 대한 표준화된 프로토콜을 제시하는 Earth Microbiome Project (이하, EMP)에서의 프로토콜을 참고하였다.

illumina Miseq 등 시퀀싱 기기를 사용할때는 illumina 社 에서 기기에 맞는 index sequence primer를 사용하므로 시퀀싱을 맞기는 입장 (샘플을 제공하는 입장)에서는 준비할 필요가 없다. 그러나, EMP 프로토콜에서는 sequencing을 더 용이하게 할 수 있는 조금은 변형된 서열의 프라이머를 사용한다. 그러므로 해당 프로토콜을 따르고 싶다면 primer를 자체적으로 제작하여 시퀀싱을 맞길 때 함께 제공해야 하고 아래의 내용은 변형된 서열의 프라이머에 대한 내용이다.

https://earthmicrobiome.org/protocols-and-standards/16s/

pad : pad는 약 10개의 뉴클레오타이드 서열로 이루어져있는데 이는 primer의 melting temperature (이하, Tm)를 65℃ 로 맞추기 위해 삽입된 서열이다. 

illumina의 Miseq을 위한 locus-specific primer 제작을 위한 가이드에서는 60~65℃ 사이에 위치하는 것을 필수로 하고 있다.
"The locus‐specific portion of primer (not including overhang sequence) must have a melting temperature (Tm) of 60°–65°C."

 

linker : linker sequence 를 추가함에 따라 어떤 16s rRNA gene (target), barcode, adapter의 서열과도 상보적이지 않게 되어 linker 이후의 서열에 인공적으로 생성된 것이 아닌 template 등의 서열이 붙지 않도록 한다. 

(linker는 단 두 개의 뉴클레오타이드로 이루어져 있는데, 물론 인공적인 서열인 linker의 길이가 길수록 특이성이 높아지지만 서열의 추가는 Tm 값에도 영향을 미치므로 두 개의 뉴클레오타이드로 합의를 본듯한 느낌이 있다.)

 

#Reference

1. Caporaso, J. Gregory, et al. "Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample." Proceedings of the national academy of sciences 108.supplement_1 (2011): 4516-4522.

2. https://earthmicrobiome.org/protocols-and-standards/16s/

 

 

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