melting temperature & annealing temperature (Tm, Ta)

 최근까지 melting temperature 가 조금 헷갈리는 단어였는데 최근에 확실하게 알게된 부분이 있어서 나중에 잊어버리기 전에 기록하기 위해 포스팅하려 합니다.

 

https://www.mun.ca/biology/scarr/PCR_simplified.html

먼저 PCR을 수행할 때 온도의 변화에 대해 간단하게 알아볼 필요가 있습니다. 

낮은 온도에서 시작하여 94℃ 정도까지 올라갔을 때 DNA denaturation 이 일어나 dsDNA 가 ssDNA로 분리됩니다. 그 이후에 50℃ 정도의 지점에서 primer 가 template DNA에 붙는 annealing 단계에 진입합니다.

 

여기서 온도와 관련된 것이 melting temp와 annealing temp입니다.

melting temp (이하, Tm) : dsDNA의 중 50% 가 ssDNA로 분리되는 온도

annealing temp (이하, Ta) : primer 가 주형가닥에 완전히 부착되기 위한 최적의 온도

 

이렇게 제가 알고 있던 각 온도에 대한 개념입니다. 그런데 제가 궁금했던 것은  Tm 이 중요하게 여겨지는 이유입니다.

프라이머를 제작하면 업체에서 프라이머의 Tm 정보를 제공하고 PCR을 수행할 때도 forward, reverse의 Tm을 고려하여 Ta를 설정하는데, 왜 Ta 정보가 아닌 Tm 정보를 제공하는가에 대한 것이었습니다.

 

프라이머를 주형 DNA 가닥에 붙이기 위해서는 프라이머가 붙기 좋은 온도인 Ta 가 더 중요한 것처럼 보이는데 dsDNA의 절반이 ssDNA 가 되는 Tm 이 프라이머와 무슨 관계가 있는지 이해가 잘 안되더라구요.

 

결론부터 말씀드리면, Tm의 개념은 정확하게 말하면 각각의 ssDNA 가 두 개 존재할 때, 절반은 붙고 절반은 떨어지는 온도입니다. 이 개념에 대해 헷갈리지 않으려면 Tm 은 단지 주형 DNA 절반이 분리되는 온도가 아니라 오히려 절반이 붙게 되는 온도이며, 이는 주형 DNA 뿐만 아니라 프라이머에도 함께 적용된다는 점입니다.

 

도입부에서 본 것처럼, dsDNA 가 94℃ 까지 올라가면서 ssDNA로 분리되는데, 50℃ 즈음으로 온도가 내려가면 완전히 떨어졌던 ssDNA 가 절반정도 서로 달라붙게 됩니다. 그런데 여기서 달라붙는 것은 PCR의 타겟인 template DNA 뿐만 아니라 기존에 ssDNA로 존재하는 프라이머도 포함되게 됩니다. 

그런데 Tm에서는 절반정도밖에 결합하지 않기에 Tm 보다 4~5℃ 정도 낮은 Ta에서 프라이머가 완벽하게 달라붙게 되고 비로소 extension 단계에 진입할 준비가 되는 것입니다. 

 

이와 관련하여 forward, reverse primer의 Tm 이 차이가 나는 경우에 두 개의 프라이머가 모두 완전하게 달라붙어야 하기 때문에 Tm 값이 더 낮은 primer를 기준으로 Ta를 설정하는 것도 이 개념과 관련되어 있습니다.

 

 

OligoCalc: Oligonucleotide Properties Calculator

+ Tm 계산할때 사용하는 사이트 첨부합니다.